小麥萌發前后淀粉酶活力的比較 - 下載本文

小麥萌發前后淀粉酶活力的比較及電泳法測定蛋白

含量

一.實驗目的

1.掌握利用光照培養箱培養小麥的方法; 2.了解酶的制備及活力測定的一般原理與方法;

3.掌握淀粉酶的活力測定技術,了解小麥萌發前后淀粉酶活力的變化; 4.鞏固對721或722S型分光光度計和離心機的熟練使用;

5.靈活運用3,5-二硝基水楊酸比色法測定樣品中還原糖含量的原理和方法; 6.掌握SDS-PAGE聚丙烯酰胺電泳法; 二.實驗原理

種子中的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在。淀粉酶是一種水解酶,它能使淀粉水解為麥芽糖,催化反應為:

2(C6H10O5)+n H2O------n C12H22O11

麥芽糖具有還原性,與3,5-二硝基水楊酸在供熱的條件下生成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內,棕色物質顏色的深淺程度與還原糖的量成正比,因此可利用比色法測定還原糖的量。

休眠種子的淀粉酶活力很弱,種子吸脹萌發后,酶活力逐漸增強,并隨著發芽天數的增長而增加。

三.實驗步驟

1.種子發芽

小麥種子浸泡2.5h后,放入25℃恒溫箱內發芽。 2.酶液提取

取發芽第三天或者第四天的幼苗8株,放入研缽中,加入石英砂少許,加入PH6.8磷酸鹽緩沖液10ml,研磨至勻漿狀。在室溫下靜置20min,攪拌幾次。提取液1500rpm離心7min。上清倒入量筒,測定酶提取液總體積,并將酶液稀釋10倍。 取干燥種子或者浸泡2.5h后的種子8粒作為對照,步驟同上。 3.SDS-PAGE聚丙烯酰胺電泳法測定蛋白條帶。 4.酶活力的測定

(1)取大試管6支,按照下表加入各試劑 (1)取大試管6支,按照下表加入各試劑

空白1酶液(ml)0.1%麥芽糖(ml)1%淀粉(ml)水(ml)10.5標準 萌發前230.50.51140.51 萌發后50.5160.51

將各試管搖勻,放入37水浴鍋中保溫3min,立即向各試管中加入DNS試劑2ml。 (2)取出各管,放入沸水浴中加熱5min,流水冷卻至室溫,加水稀釋至25mL,充分混勻后1:1稀釋。用空白管做對照,在520nm處測定各管OD值,并對3和4、5和6管分別取平均值作為萌發前和萌發后的OD值。 四.計算

根據溶液的濃度與光吸收值成正比的關系,即

A標準/A未知=C標準/C未知 可推導出C酶液=A酶液/A標準×C標準 8粒的總活力=C酶×n酶×V酶

A為光吸收值;C酶=酶液管的麥芽糖濃度;n酶=酶液稀釋倍數;V酶=提取酶液總體積。

五.蛋白質濃度測定--考馬斯亮藍G250染色法

蛋白質定量測定

溶液

0管

酶液(萌發前) 酶液(萌發后) 0.1 0.1

蛋白液/mL --

0.9%生理鹽水/mL 1.0 0.9 0.9 蛋白質染色液/mL 5.0 5.0 5.0 輕輕搖勻,5min后以0管調空白,595nm分光光度法測光密度值。

六、實驗結果

(1)酶活力的測定

酶提取液總體積

酶液最終稀釋后測定的小麥萌發前與萌發后的OD值

OD值 平均值 空白 1 標準 2 0.248 0.248 3 0.217 0.201 萌發前 4 0.185 5 0.612 0.641 萌發后 6 0.669 萌發前 9ml 萌發后 8ml n酶=10×(25/0.5)×2=1000 ,A標準=0.248,C標準=0.001%,

1、 萌發前:A酶液=0.201, V酶=9.0ml

C酶液=A酶液/A標準×C標準=0.201/0.248×0.001% 8粒的總活力=C酶×n酶×V酶=0.0729

2、萌發后:A酶液=0.641, V酶,=8.0ml, C酶液=A酶液/A標準×C標準=0.641/0.248×0.001% 8粒的總活力=C酶×n酶×V酶=0.207

(2)蛋白質濃度的測定

OD值 平均值 小麥萌發前: A蛋白質=0.113

由標準曲線,Y=0.0081X — 0.0515,R2=0.9842可知,x為20.3086,由于酶液被稀釋了10倍,所以,蛋白質濃度為203.086μg/ ml。 小麥萌發后: A蛋白質=0.096

由標準曲線,Y=0.0081X — 0.0515,R2=0.9842可知,x為 18.2099,由于酶液被稀釋了10倍,所以,蛋白質濃度為182.099μg/ ml。

1 0.104 0.113 萌發前 2 0.121 3 0.064 0.096 萌發后 4 0.128 七、討論

由實驗數據結果可以看出小麥萌芽后淀粉酶的活力會比萌芽前明顯增強,小麥種子在萌發過程中淀粉酶活力升高,淀粉被大量水解為小分子糖,那么就可以提供較多的能量供應萌發時候的細胞分裂以及細胞生長使用,同時還能夠為細胞的生命活動提供原料,能夠更快地將儲存的有機物中的能量釋放出來,保證萌發過程能量供應充足。

八、實驗注意事項

1、種子研磨應均勻,以助于酶液的提取。

2、在測定蛋白質濃度及酶液時,應快速測量,以防止反應試劑的分解,提高測定的正確性。 3、實驗過程中注意安全。





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